本制品是一种高效快速去糖基化试剂盒。与去糖基化酶(PNGase F)(货号：YTC0005)去除N-糖基化修饰需要几小时甚至过夜相比，本试剂盒仅需50℃孵育10分钟即可完成对糖蛋白N-聚糖链的去除，可有效缩短样品处理时间，处理后的样品可用于SDS-PAGE、Western、高效液相色谱(HPLC)或质谱分析(Mass spectrometry)等。本试剂盒也可以间接用于抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的糖基化水平检测。
Rapid PNGase F与PNGase F功能相同，通过E.coli重组表达，可以在几乎所有类型的N-多糖如高甘露糖(High mannose)、混合型和复杂寡聚糖(Hybrid and complex oligosaccharides)的最内端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc,N-acetylglucosamine)和天冬酰胺(Asparagine,Asn)残基的连接处切割，从而移除N-寡聚糖(N-linked oligosaccharides)，将蛋白和糖链修饰分开(图1)。本试剂盒提供的Rapid PNGase F的N端带有His-tag，反应后通过相应的His抗体琼脂糖凝胶、磁珠或镍柱吸附去除。
图1．使用本试剂盒移除N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的示意图。糖链可以在图中戊糖(Pentasaccharide)的R1、R2和R3位置延伸。R1位置只能是空缺或α-6 fucose，不能是α-3 fucose，否则就不能被Rapid PNGase F切割。R2和R3位置可以是任意的单糖或多糖。
本试剂盒去除不同种属IgG的N-糖基化修饰效果如图2所示。
图2．使用本试剂盒去除不同种属IgG的N-糖基化修饰效果图。IgG蛋白经过变性处理后内部二硫键全部破坏，抗体重链(Heavy chain,HC)和轻链(Light chain,LC)发生分离。图中为抗体重链部分的电泳条带。C (Control)为未处理的对照。RP1为使用Rapid PNGase F一步法反应，RP2为两步法反应。在20μL反应体系中，10μg不同种属的IgG分别加入1μL Rapid PNGase F，50℃孵育10分钟。Std (Standard denaturing reaction with SDS)为10μg不同种属的IgG加入1μL 去糖基化酶(PNGase F)，37℃孵育4小时的结果。经PAGE预制胶(Hepes,4～15%,15孔)电泳，并经考马斯亮蓝超快染色液染色。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
糖基化修饰(Glycosylation)是一种蛋白质翻译后修饰(PTM)，几乎存在于所有生物体中，包括真核生物、真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaea)。糖基化修饰的多样性会改变蛋白的质量和电荷，在蛋白质分类、免疫识别、受体结合、炎症、致病性和许多其他过程中发挥着关键的生物功能。最新的研究表明，核酸也存在糖基化修饰。
抗体药物的生产中调节和控制糖基化修饰对抗体的活性、药代动力学和免疫原性都有着重要影响。例如在IgG的Fc部分Asn297处有一个保守的N-聚糖链，很多抗体还有额外的N-聚糖链，这些N-聚糖链可能对抗体的活性、半衰期和免疫反应至关重要；而且细胞培养过程中的变量，可能进一步增加抗体糖基化修饰的多样性，因此N-聚糖链的表征和质量控制是抗体药物的关键质量属性(CQAs)之一。
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应和非变性去糖基化修饰反应。
- 变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；
- 非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。
| 组分 | 25T | 100T | 500T |
| Rapid PNGase F | 25μL | 100μL | 500μL |
| 5×Denaturing Reaction Buffer | 100μL | 400μL | 2mL |
保存：-20℃，有效期1年。
本试剂盒用于移除糖蛋白或糖肽的N-糖苷酶切反应时，如果按照每次使用1μL Rapid PNGase F在50℃反应10分钟，本制品小、中、大包装分别可以用于25、100和500次反应。
- Rapid PNGase F不能水解含有core α1-3 Fucose的N-糖苷(常见于植物及昆虫糖蛋白，此时需要使用PNGase A)。
- 避免使用含有SDS的缓冲液，SDS会抑制Rapid PNGase F的酶活性。
- Tween、Triton X-100、NP-40、辛基葡萄糖苷(Octyl glucoside)、非去垢剂磺基甜菜碱，以及有机溶剂都会抑制Rapid PNGase F的酶活性。
- 超纯水推荐选购无菌无酶超纯水。
通常采用一步法反应，即可高效完成去N-糖基化修饰反应，但是部分糖蛋白(例如某些IgG的Fab部分存在N-糖基化修饰)需要在80℃加热2分钟进行预变性充分暴露N-糖基化修饰位点，才能有效去除全部N-聚糖链。建议用户优先采用一步法反应，如果后续SDS-PAGE电泳或蛋白质组学分析表明蛋白仍旧有N-聚糖链残留，再采用两步法反应。
- 一步法反应：
- 按下表在1.5mL离心管中配制反应体系，并充分混匀。
成分 用量 Protein (10～100μg) x μl 超纯水 (15-x)μL 5×Denaturing Reaction Buffer 4μL Rapid PNGase F 1μL 总体积 20μL - 50℃孵育10分钟。
- 后续即可进行SDS-PAGE、Western等常规分析。也可以根据需要酌情对N-聚糖进行衍生化(例如Reductive amination)，以便进行下游分析。如果后续采用质谱分析去糖基化蛋白，推荐使用BalbDesalt脱盐柱对溶液进行置换。
- 按下表在1.5mL离心管中配制反应体系，并充分混匀。
- 两步法反应：
- 按下表在1.5mL离心管中配制反应体系，并充分混匀。
成分 用量 Protein (10～100μg) x μl 5×Denaturing Reaction Buffer 4μL 超纯水 至19μL - 80℃加热2分钟。
- 冷却至室温，加入1μL Rapid PNGase F，混匀后50℃孵育10分钟。
- 后续即可进行SDS-PAGE、Western等常规分析。也可以根据需要酌情对N-聚糖进行衍生化(例如Reductive amination)，以便进行下游分析。如果后续采用质谱分析去糖基化蛋白，推荐使用百奥莱博的BalbDesalt脱盐柱对溶液进行置换。
- 按下表在1.5mL离心管中配制反应体系，并充分混匀。
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